D۳۲۵
۳۲۵
۲۵۰E=
E۳۲۵
۳۲۵
۱۲۵F=
F۱۰۰
۴۰۰
۲۵G=
سپس دﺳﺘﮕﺎه اﺳﭙﻜﺘﺮوﻓﺘﻮﻣﺘﺮ روی ﻃﻮل ﻣﻮج nm 595 ﺗﻨﻈﻴﻢﺷﺪ. ابتدا ﺗﻮﺳﻂ ﻧﻤﻮﻧﻪ ﺷﺎﻫﺪ ﻛﻪ ﺗﻨﻬﺎ ﺣﺎوی ﻣﺤﻠﻮل ﺑﺮدﻓﻮرد و بافر مورد استفادهﺑﻮد، دﺳﺘﮕﺎه روی ﺻﻔﺮ ﺗﻨﻈﻴﻢ ﺷﺪه و ﻛﺎﻟﻴﺒﺮهﮔﺮدﻳﺪ. پس از آن ۱۰۰ میکرولیتر از هر نمونه برداشته و به آن ۵ میلی لیتر معرف برد فورد اضافه شد. پس از هموژن کردن[۷۳] جذب نمونه ها اندازه گیری شده و منحنی کالیبراسیون بر مبنای ضریب جذب و غلظت پروتئین ترسیم گردید. بر طبق آنچه در استاندارد روش برد فورد ذکر شده، برای ترسیم منحنی ، لزوماً می بایست از همان بافری استفاده شود که برای استخراج پروتئین از نمونه ها استفاده گردید ]۷۰[. به همین منظور همانطور که در ادامه ذکر خواهد شد، به دلیل استفاده از ۴ نوع بافر برای استخراج پروتئین، ۴ منحنی استاندارد همانطور که در شکل های ۳-۱۴ تا ۳-۱۷ مشخص است، ترسیم گردید. سپس ﺟﺬب ﻧﻮری ﻧﻤﻮﻧﻪﻫﺎی ﻣﺠﻬﻮل، ﻳﺎ ﭘﺮوﺗﺌﻴﻦﻫﺎی اﺳﺘﺨﺮاج ﺷﺪه در دﺳﺘﮕﺎه ﺧﻮاﻧﺪه ﺷﺪ. ﺑﻌﺪ از ﻣﺸﺨﺺ ﺷﺪن ﻣﻌﺎدﻟﻪ ﻧﻬﺎﻳﻲ ﺧﻂ رﮔﺮﺳﻴﻮن بر طبق معادلات ۳-۹ تا ۳-۱۲، ﻏﻠﻈﺖ ﭘﺮوﺗﺌﻴﻦ در ﻧﻤﻮﻧﻪﻫﺎ ﺗﻌﻴﻴﻦﮔﺮدﻳﺪ. که در خط استاندارد بدست آمده محور x غلظت پروتئین بر حسب گرم بر لیتر و y میزان جذب در ۵۹۵ نانومتر است.
بافر فسفات:
(۳-۹) ۰۲۸/۰x+۲۹۲/۰ y =
شکل ۳-۱۴: منحنی استاندارد BSA با بافر فسفات جهت سنجش میزان پروتئین
بافر کربنات-بی کربنات:
(۳-۱۰) ۰۰۳/۰x +۲۴۹/۰ y =
شکل ۳-۱۵: منحنی استاندارد BSA با بافر کربنات-بی کربنات جهت سنجش میزان پروتئین
آب مقطر:
(۳-۱۱) ۰۷۸/۰x+۲۷۹/۰ y =
شکل ۳-۱۶: منحنی استاندارد BSA با آب مقطر جهت سنجش میزان پروتئین
بافر سیترات:
(۳-۱۲) ۰۲۷/۰–x۲۸۴/۰ y =
شکل ۳-۱۷: منحنی استاندارد BSAبا بافر سیترات جهت سنجش میزان پروتئین
۳-۱۹– محاسبه فعالیت سلولتیکی[۷۴]
فعالیت سلولتیکی در واقع میزان توانایی میکروارگانیسم را برای مصرف سوبسترای لیگنوسلولزی نشان می دهد. از آن جایی که بخش عمده ساختار لیگنوسلولزی باگاس را سلولز تشکیل می دهد از میزان جامد باقیمانده می توان به میزان مصرف سلولز پی برد و توانایی میکروارگانیسم را در این زمینه بررسی کرد. برای این کار نمونه های جامد حل شده در بافر با بهره گرفتن از پمپ خلاء فیلتر گردیده و مواد باقیمانده روی سطح کاغذ صافی به طورکامل با آب مقطر شستشو داده شد. سپس در آون در دمای ۱۰۵ درجه سانتی گراد قرار داده شد تا خشک شود. میزان فعالیت سلولتیکی از رابطه ۳-۱۳ بدست می آید ]۷۱[:
(۳-۱۳)
(وزن سوبسترای اولیه)/ )وزن سوبسترای باقیمانده – وزن سوبسترای اولیه) ×۱۰۰=درصد فعالیت سلولتیکی
۳-۲۰– بررسی تأثیر پارامترهای مختلف بر تولید پروتئین
۳-۲۰-۱– تأثیر نوع بافر استخراج
برای اندازه گیری میزان پروتئین ابتدا باید پروتئین تولید شده روی نمونه های جامد وارد فاز مایع گردد. بدین منظور باید از بافر استخراج مناسب استفاده شود. بافر ۱/۰ مولار فسفات )۷ (pH=،بافر ۱/۰ مولار سیترات )۵ (pH=، بافر ۲/۰ مولار کربنات-بی کربنات )۱۰ (pH=و آب مقطر برای استخراج پروتئین استفاده شد. لازم به ذکر است که این آزمایش در خارج از بیورآکتور و داخل ارلن مایر در انکوباتور و در دمای ۳۰ درجه سانتی گراد انجام شد. مدت زمان انجام آزمایش ها ۲۴ ساعت بود.
۳-۲۰-۱-۱– روش تهیه بافر ۱/۰ مولار فسفات )۷ (pH=
برای تهیه این بافر به محلول های ۱ مولار از پتاسیم هیدروژن فسفات (K2HPO4) و پتاسیم دی هیدروژن فسفات (KH2PO4) نیاز است. بدین منظور ۸۰۴/۶ گرم KH2PO4 و مقدار ۱۹/۱۲ گرم K2HPO4 به ترتیب در۵۰ و ۷۰ میلی لیتر آب مقطر حل شد تا محلول ۱ مولار از هرکدام تهیه شود. پس از آن میزان ۵/۶۱ میلی لیتر از محلول اول و ۵/۳۸ میلی لیتر از محلول دوم در یک بالن ژوژه ۱۰۰ میلی لیتری ریخته و به حجم رسانده شد.
۳-۲۰-۱-۲– روش تهیه بافر ۱/۰ مولار سیترات )۵ (pH=
محلول ۱/۰ مولار سدیم سیترات (Na2C6H5O7) را با بهره گرفتن از ۹۴۱/۲ گرم از این ماده در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر تهیه کرده تا محلول سدیم سیترات ۱/۰ مولار حاصل شود. ۱۰۱/۲ گرم از اسید سیتریک (C6H8O7) را نیز در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل کرده تا مولاریته این محلول ۱/۰ شود. سپس ۵/۴۶ میلی لیتر از محلول سیتریک اسید و ۳/۵۳ میلی لیتر از محلول سدیم سیترات با هم مخلوط شده و به حجم ۱۰۰ میلی لیتر رسانده شد.
۳-۱-۲۰-۳–روش تهیه بافر ۲/۰ مولار کربنات-بی کربنات )۱۰ (pH=
برای تهیه این بافر محلول ۲/۰ مولار سدیم کربنات (Na2CO3)و محلول ۲/۰ مولار سدیم بی کربنات (NaHCO3) مورد نیاز است. بدین منظور ۱۲/۲ گرم سدیم کربنات و ۶۸/۱ گرم سدیم بی کربنات را در ۱۰۰ میلی لیتر آب مقطر حل کرده و پس از آن ۵/۲۷ میلی لیتر از محلول اول و ۵/۲۲ میلی لیتر از محلول دوم برداشته و در یک بالن ژوژه به حجم ۱۰۰ میلی لیتر رسانده شد.
۳-۲۰-۲– تأثیر رطوبت اولیه سوبسترا
تأثیر میزان رطوبت اولیه سوبسترای جامد (باگاس) نیز در این تحقیق مورد بررسی قرار گرفت. رطوبت اولیه سوبسترا به صورت نسبت محیط مایع (محیط کشت حاوی مخمر) به محیط جامد خشک (باگاس) تعریف می شود. نمونه هایی با رطوبت اولیه ۳۰ تا ۹۰% با گام افزایشی۱۰% مورد آزمایش قرار گرفت.
۳-۲۰-۳– تأثیر مدت زمان تخمیر
یکی از مهم ترین پارامترهایی که بر تولید پروتئین تأثیرگذار است پارامتر زمان می باشد. به این منظور میزان تولید پروتئین در نمونه های داخل سینی ها به فاصله زمانی ۲۴ ساعت به مدت ۴ روز در دماهای ۲۵، ۳۰ و ۳۵ درجه سانتی گراد مورد بررسی قرار گرفت تا تعیین گردد بیش ترین میزان پروتئین در چه زمانی از تخمیر تولید خواهد شد.
۳-۲۰-۴– تأثیر غنی سازی سوبسترا با منبع نیتروژنی
تولید پروتئین تحت تأثیر نوع منبع نیتروژنی مورد استفاده در غنی سازی سوبسترا قرار دارد. در این پروژه باگاس با منابع نیتروژنی مختلف ( w/w۳%) نظیر سدیم نیترات (NaNO3)، عصاره مخمر(yeast extract)، آمونیوم کلراید (NH4Cl) و اوره (CH4N2O) غنی سازی شد و میزان تولید پروتئین با هم مقایسه شد.
۳-۲۰-۵– تأثیر رطوبت داخل بیورآکتور
