۵-به کمک دستگاه Washing ELISA هر پلیت سه بار و هر بار با ۳۰۰ میکرولیتر بافر شستشو به ازا هر چاهک شستشو داده شد
۶ – پس از تخلیه کامل بافر ، به هر چاهک ۱۰۰ میکرولیتر از آنزیم کونژوگه (پراکسیداز متصل به آنتی هیومن IgG) اضافه شد و ۳۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد.
۷ – شستشو مطابق بند ۵ تکرار شد.
۸ – پس از تخلیه کامل ، به هر چاهک ۱۰۰ میکرولیتر سوبسترا اضافه شد و به مدت ۱۵ دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد.
۹ – ۱۰۰ میکرولیتر محلول متوقف کننده به هر چاهک اضافه شد.
۱۰ – جذب نوری در ۴۵۰ نانومتر با طول موج رفرنس ۶۳۰ نانومتر با طول موج رفرنس ۶۳۰ نانومتر توسط دستگاه ELISA reader اندازه گیری شد .
۳-۱۴- اندازه گیری IgG Avidity Index با بهره گرفتن از کیت تجاری Microgen
به منظور بررسی نتایج ناهمخوان بدست آمده بین کیت Euroimmun و آنتی ژن های پروتئینی GRA6 وGAR7 از کیت Microgen استفاده گردید.
اصل آزمون:
در این کیت از نوارهای تست حاوی پروتیین نوترکیب با خلوص بالا در غشانیتروسلولوز استفاده میشود.این ماتریکس سپس به نوارهایی برش میشود.
به منظور تسهیل در تشخیص آنتی بادی خاص توکسوپلاسما نوارها در سرم یا پلاسمای رقیق شده انکوبه میشود،و به موجب آن آنتی بادی به نوار آنتی ژن اتصال می یابد.اگر واکنش آنتی ژن – آنتی بادی صورت بگیرد یک خط تیره در منبع آنتی ژنی مربوطه روی نوار خاص نمود پیدا میکند.توجه شود ۲استریپ برای انجام آزمایش اویدیتی نوترکیب با کیت میکروژن نیاز است.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

روش آزمون:
اویدیتی یک معیار اندازگیری قدرت اتصال بین آنتی بادی وآنتی ژن(متناظر با آن) است.تعیین مقدار اویدیتی با کمک کیت باآنتی بادی های ضد توکسوپلاسما با بهره گرفتن از معرف اویدیتی موجود در کیت میکروژن ممکن است.آنتی بادی ها معمولا در حال بلوغ هستند.
آنتی بادی های IgGاویدیتی پایین را در مراحل اولیه بیماری(دوره حاد) نشان میدهد.در حالی که آنتی بادیها در مراحل مزمن بیماری اویدیتی بالا را نشان میدهند.
در موارد اویدیتی پایین ،اتصال بین آنتی ژن آنتی بادی به قدری ضعیف است که میشود آن را با استفاده ازمعرف اویدیتی حل کرد به طوری که می توان آنتی بادی را از سمت اتصال در استریپ ها شست. آنتی
بادی با اویدیتی بالا اتصال قوی به آنتی ژن را نشان میدهد که نمیتوان آن را با معرف اویدیتی حل کرد.
ارزیابی شدت باند ها روی نوار تستها بر اساس نوار کنترل چاپ شده بر روی کاغذ ارزیابی در پروتکل کیت میکروژن امکان پذیر میباشد.
مواد ووسایل مورد نیاز :

• • • • کیت تجاری IgG Avidity Microgen
    • • ELISA reader
    • • سمپلر Multichannel و سر سمپلر
    • • دستگاه Washing ELISA

1. 1. در ابتدا کیت را به همراه مواد دیگر در محیط اتاق می گذاریم تا به دمای اتاق برسند.

1. 1. ۲ml از wash buffer در داخل هر استریپ به آرامی ریخته شد، سپس بوسیله یک گیره پلاستیکی به آرامی نوارهای آزمایش را در داخل چاهک ها می اندازیم، باید دقت کنیم که استریپ ها در داخل محلول فرو داده شده اند و همچنین شماره نوارها باید به سمت بالا باشند.

1. 1. سپس ۲۰میکرولیتر از نمونه سرمی را در داخل استریپ ها اضافه می کنیم ، نمونه سرمی به رقت ۱به ۱۰۰ آماده شده بود، کاور جعبه راگذاشته و به مدت ۱ ساعت در دمای اتاق بر روی شیکر میگذاریم.

1. 1. استریپ ها را در داخل چاهک ها ۳بار و هر بار با ۲میلی لیتر از wash buffer به مدت ۵ دقیقه شستشو میدهیم وهر بار که شستشورا انجام می دهیم بر روی شیکر میگذاریم

1. 1. در یکی از چاهک ها محلول اوره و در دیگری محلول wash میریزیم وبه مدت ۳۰ دقیقه بر روی شیکر میگذاریم.

1. 1. مطابق بند ۴ شستشو را انجام می دهیم.

1. 1. ۲میلی لیتر از کونژوگه دایلوشن به هر چاهک اضافه میکینیم وبه مدت ۴۵ دقیقه در دمای اتاق بر روی شیکر انکوبه مینمائیم

1. 1. مطابق مرحله۵شستشو راتکرار میکنیم.

1. 1. ۵میلی لیتر از سوبسترا به هر چاهک اضافه میکنیم وبه مدت ۵-۱۰ دقیقه در دمای اتاق بر روی شیکر قرار می دهیم.

1. 1. بعد از خالی کردن چاهک ها با محلول سوبسترا ، نوارها را ۳بار با آب دیونیزه شستشو می دهیم.

با بهره گرفتن از گیره پلاستیکی نوارها را از چاهک ها خارج کرده ومیان دو لایه کاغذی گذاشته و به مدت ۲ ساعت در یک جای خشک نگهداری می کنیم.
بعد از اینکه نوارهای کاغذی (مثل شکل ۲-۱)که یکی با محلول اوره وآن یکی با محلول PBS شستشو داده شده اند خشک شدند با همدیگرمقایسه میگردند. با مقایسه کردن آنتی ژن های P30وrSAG1 وGRA1وMAG1 روی نوار وتطابق آن با جدول۲-۱ نتایج کیت را بدست میاوریم.

IgG IgA IgM Cutoff Rop1c MIC3 GRA7 GRA8 p30 MAG1
شکل۳-۱:نوارهای کیت میکروژن MAG1 rSAG
جدول۳-۱: جدول ارزیابی اویدیتی در کیت میکروژن

recomline Toxoplasma
(phase specific recombinant antigens)